【文獻分享】泛組蛋白脫乙?；敢种苿┛稍鰪妼?shí)體瘤中B7-H3特異性CAR T細胞的抗腫瘤活性

引導語(yǔ)：

2021年6月23日，中國首款CAR T藥-阿基侖賽注射液獲得國家藥品監督管理局批準上市。這是一種自體免疫細胞注射劑，由攜帶CD19 CAR基因的逆轉錄病毒載體進(jìn)行基因修飾的自體靶向人CD19嵌合抗原受體T細胞（CAR T）制備，用于治療既往接受二線(xiàn)或以上系統性治療后復發(fā)或難治性大B細胞淋巴瘤成人患者，這將開(kāi)啟中國腫瘤細胞治療的新未來(lái)。

CAR T技術(shù)出現了多年并經(jīng)歷了諸多改進(jìn)才逐漸進(jìn)入臨床，除了被用來(lái)治療急性白血病和非霍奇金淋巴瘤，改進(jìn)后也被用來(lái)治療實(shí)體瘤、自身免疫疾病、HIV感染和心臟病等疾病。近年來(lái)，國內外已經(jīng)有很多關(guān)于CAR T細胞的研究和報導。2021年4月2日，在期刊Clinical Cancer Research（影響因子IF=10.107）發(fā)表了一篇標題為“A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-Specific CAR T Cells in Solid Tumors”的論文，研究泛組蛋白脫乙?；敢种苿?shí)體瘤中B7-H3.CAR T細胞的抗腫瘤活性的影響。

接下來(lái)小編就給大家介紹一下這篇高分文獻。

一、B7-H3在實(shí)體癌細胞上的表達及其與多種實(shí)體癌患者生存率的關(guān)系

B7-H3，也稱(chēng)為CD276，它是一種免疫檢查點(diǎn)分子，屬于免疫檢查點(diǎn)抑制劑B7超家族。它的生物學(xué)特性功能目前尚不清楚，它的功能是共刺激或者共抑制分子取決于它所參與的免疫反應。在這篇文章，作者為了測試表觀(guān)遺傳療法是否可以增強 B7-H3.CAR T細胞對多種實(shí)體癌類(lèi)型的抗腫瘤活性，通過(guò)in vitro和ex vitro實(shí)驗，評估了B7-H3.CAR T 細胞和脫乙酰酶抑制劑 (SAHA) 聯(lián)合治療幾種實(shí)體癌的療效和潛在機制。結果發(fā)現B7-H3 在大多數人實(shí)體瘤樣本中會(huì )表達，但在正常組織中表達受限，B7-H3.CAR T 細胞在體外選擇性殺死表達 B7-H3 的人癌細胞系。

作者采用中山紀念醫院和中山大學(xué)自2007年4月至2013年12月期間收集的186例三陰性乳腺癌（TNBC）樣本，298例頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）標本樣本，152個(gè)非小細胞肺癌（NSCLC）樣本和89例皮膚黑色素瘤（SKCM）樣本用于B7-H3染色和分析。另外，采用中山紀念醫院和中山大學(xué)自2016年5月至2018年11月期間收集的47例頭頸部鱗狀細胞癌樣本和39例三陰性乳腺癌樣本建立病人來(lái)源的異種移植模型。采用50ml健康獻血者的外周血，以及70ml頭頸部鱗狀細胞癌患者和三陰性乳腺癌患者的外周血建立這兩種癌癥細胞系，建議TNBC-S3和HNSCC-Y2細胞系，以產(chǎn)生CAR T細胞。

首先，作者評估了B7-H3在實(shí)體癌和正常組織中的表達。如圖1所示，B7-H3廣泛表達于多種實(shí)體癌，但在正常組織有限表達。低表達B7-H3的TNBC，HNSCC，以及SCLC癌癥患者的存活率更長(cháng)。B7-H3表達升高與腫瘤患者的短存活率有關(guān)。因此，B7-H3不僅是實(shí)體癌的一個(gè)預后生物標志物，而且是腫瘤免疫治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

圖1：B7-H3在實(shí)體癌細胞上的表達及其與多種實(shí)體癌患者生存率的關(guān)系。圖片來(lái)源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

二、脫乙酰酶抑制劑 (SAHA)可顯著(zhù)增加多種人實(shí)體癌細胞的B7-H3的表達

實(shí)體瘤中的抗原異質(zhì)性是CAR T細胞的免疫治療的主要障礙之一?？乖S富區域促進(jìn)了CAR T細胞的招募以及CAR T細胞和靶細胞之間的相互作用。組蛋白脫乙?；敢种苿┮呀?jīng)被證明可以有效的上調轉錄激活。因此，作者檢測了組蛋白脫乙?；敢种苿┦欠衲茉鰪夿7-H3在實(shí)體癌細胞中的表達。如圖2?？紤]到劑量限制毒性和其他臨床試驗中觀(guān)察到的與組蛋白脫乙?；敢种苿┫嚓P(guān)的不良反應，作者篩選了一系列的組蛋白脫乙?；敢种苿?，結果發(fā)現SAHA可以最有效的上調B7-H3的表達，如0.5 mmol/L的SAHA可以誘導B7-H3表達水平上調兩倍，并且SAHA可以上調B7-H3轉錄和蛋白水平。同時(shí)檢測了B7-H3在經(jīng)SAHA處理的多種正常人細胞上的表達，包括原代舌肌細胞，原代胃上皮細胞細胞，原代十二指腸細胞，原代肝細胞，原代胰腺細胞和原代卵巢細胞，發(fā)現SAHA沒(méi)有增加B7-H3在人類(lèi)正常細胞表面的表達。

圖2：SAHA通過(guò)組蛋白修飾顯著(zhù)增加了多種人實(shí)體癌B7-H3的表達。圖片來(lái)源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

三、SAHA可顯著(zhù)增強實(shí)體瘤細胞共培養的B7-H3. CAR T細胞的特異性細胞毒性

如圖3，相比于未預處理的癌細胞，SAHA預處理的CAR T細胞共培養的癌細胞，經(jīng)過(guò)24小時(shí)的孵育后，細胞上清中四種細胞因子：GMCSF，IFNγ，IL2和TNFα顯著(zhù)增加。說(shuō)明SAHA可增強實(shí)體癌細胞對B7-H3.CAR T細胞的敏感性，并增強B7-H3.CAR T細胞在共培養體系中的細胞毒活性。

圖3：SAHA可增強實(shí)體癌細胞對B7-H3.CAR T細胞的敏感性，并增強B7-H3.CAR T細胞在共培養體系中的細胞毒活性。圖片來(lái)源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

四、SAHA可抑制B7-H3.CAR T免疫抑制信號通路以及增強蛋白質(zhì)轉運信號通路

作者進(jìn)行mRNA分析以檢測B7-H3.CAR T細胞轉錄組在SAHA處理下的變化。如圖4，SAHA顯著(zhù)改變了轉錄組，有6172個(gè)基因表達顯著(zhù)上調，6225個(gè)基因表達顯著(zhù)下調。然后，采用基因富集分析去鑒定CAR T改變的細胞表型，發(fā)現與蛋白質(zhì)運輸相關(guān)的基因上調，而與免疫抑制和未折疊蛋白質(zhì)反應相關(guān)的基因下調。

甲基胞嘧啶二氧酶（TET2）在最近的研究中證明可以有效調節CD19.CAR T細胞。因此，作者研究了TET2的潛在作用。如圖4 E–I，敲除B7-H3.CAR T細胞的TET2后，CAR T細胞釋放的四種細胞因子GM-CSF，IFN-γ，IL-2, TNF-α增多，細胞的毒性活性增加，釋放的穿孔素和顆粒酶B也增多。因此，SAHA可以通過(guò)上調蛋白轉運信號通路增加T細胞表面B7-H3.CAR的表達。此外，SAHA還會(huì )影響B(tài)7-H3.CAR T細胞中細胞毒性機制的關(guān)鍵成分TET2。

圖4：SAHA上調蛋白質(zhì)轉運信號通路和減少免疫抑制分子的表達，例如CTLA-4和TET2，圖片來(lái)源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors

五、SAHA可增強異種移植模型中B7-H3.CAR T細胞的抗腫瘤活性

作者用體內實(shí)驗測試SAHA和B7-H3聯(lián)合治療，首先建立第0代（P0）小鼠原位細胞系。如圖5，在CAR T細胞注入后的第30天，聯(lián)合治療顯著(zhù)控制了腫瘤的生長(cháng)，聯(lián)合治療組的凋亡癌細胞百分比、B7-H3表達水平和腫瘤浸潤T細胞數也最高，在SAHA和B7-H3.CAR T細胞治療組中也發(fā)現了比其他組更具浸潤性的生成IFNγ的T細胞。

圖5：SAHA和B7-H3聯(lián)合的CAR-T細胞在TNBC和HNSCC異種移植小鼠模型中表現出良好的腫瘤控制作用。圖片來(lái)源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

六、結論

綜上所述，作者從人源化mab 8H9中獲得B7-H3.CAR T細胞，篩選了組蛋白脫乙?；敢种苿?，發(fā)現SAHA介導可以上調B7-H3在實(shí)體癌細胞中的表達以及B7-H3.CAR T細胞在人T細胞中的表達。SAHA和B7-H3.CAR T細胞的聯(lián)合后對多種類(lèi)型的人實(shí)體癌的抗腫瘤活性增加。

重頭戲來(lái)了!

在這篇高分文獻中，作者在異體移植模型中分析腫瘤浸潤性的生產(chǎn)IFNγ的T細胞，采用的是酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法去定量生產(chǎn)IFNγ的T細胞。采用的試劑盒是達科為的達優(yōu)系列Human IFN-γ Precoated ELISPOT Kit（cat#2110001和cat# 2110005），如下圖。

 

產(chǎn)品介紹

達科為公司的達優(yōu)^?系列Human IFN-γ Precoated ELISPOT Kit采用原裝進(jìn)口高親和力高效價(jià)抗體對，經(jīng)預包被PVDF板、低溫干燥、真空密封包裝等工藝流程制備。成品PVDF板上預包被的抗體分布均勻、效價(jià)穩定，實(shí)驗檢測時(shí)間從3天縮短為2天，大幅度減少無(wú)菌操作的實(shí)驗步驟，減輕實(shí)驗者的勞動(dòng)強度和減少污染的幾率，使得實(shí)驗者能夠輕松、高效地完成復雜的ELISPOT檢測實(shí)驗。

■ 應用范圍：本試劑盒專(zhuān)用于科研。

■ 保存條件：2-8℃可穩定保存12個(gè)月。

齊全的產(chǎn)品

達優(yōu)系列ELISPOT試劑盒分人和小鼠兩種種屬，涵蓋多種指標，有可拆卸和不可拆卸板條；并且也提供ELISPOT的輔助試劑和讀板服務(wù)，為您的ELISPOT實(shí)驗保駕護航。

參考文獻：

Lei, Xinyuan, et al. A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3–Specific CAR T Cells in Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 2021.

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